研究进展|基因II型ASFV正在进化为毒性较小的形式?ASFV流行毒株临床表现及ASF诊断测试比较汇总

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研究进展|基因II型ASFV正在进化为毒性较小的形式?ASFV流行毒株临床表现及ASF诊断测试比较汇总

欧盟非洲猪瘟参考实验室学者Gallardo C., Fernández-Pinero J.和Arias M.等人基于欧盟ASF(EURL)参考实验室在根据欧盟国家的目前ASF流行情况所获得的经验和数据对ASF诊断的最新知识进行了综述,特别是关于结果的解释及其在流行病学调查中的作用,为准确解释ASF诊断结果提供了指导。文章信息如下:

摘要

由于没有可用的疫苗,因此防控和根除非洲猪瘟(ASF)的基础是进行适当的监视和严格的卫生管理措施。监测活动的成功取决于是否有最适当的诊断测试。虽然许多可用的ASF诊断技术均经过验证,但对ASF诊断结果的解释可能很复杂。原因在于不同背景下流行病学的复杂性以及病毒传播的特点,导致了ASF临床表现形式多样。

本综述基于欧盟ASF(EURL)参考实验室在根据欧盟国家的目前ASF流行情况所获得的经验和数据,着重介绍了ASF诊断的最新知识,特别是关于结果的解释及其在流行病学调查中的作用,为准确解释ASF诊断结果提供了指导,这些诊断结果与不同的临床表现有关,从急性到慢性的疾病,包括无明显症状的感染。

01

简介

非洲猪瘟(ASF)是最复杂的猪的传染性病之一。非洲猪瘟死亡率极高,传播迅速,会对猪和猪肉产品的国际贸易产生的巨大的社会经济和卫生影响。非洲猪瘟的病原体是非洲猪瘟病毒(ASFV),该病毒是一种大的,有囊膜的双链DNA病毒,是非洲猪瘟病毒科的唯一成员。根据编码其衣壳蛋白p72的B646L基因,ASFV被分为24个不同的基因型。

六开彩预测内部2018年8月以来,ASFV展示了其巨大的跨国界和跨大陆传播的能力,向亚洲国家的持续传播,在中国、越南、蒙古、柬埔寨、朝鲜都已确认检测到该病,全世界ASF流行病学发生了新的变化,该疾病可能已呈现全球流行。这将使得ASF的控制更加困难。

虽然ASF在一个世纪前就已首次被描述,但是,时间证明,在没有疫苗或治疗方法的情况下对这种疫病的防控是一种严峻挑战。ASF的传播只能通过早期发现和严格遵守传统疾病的控制方法来预防,包括监测、流行病学调查、猪的追踪、淘汰受感染的牲畜、严格的检疫和生物安全措施以及动物的迁移控制。想要成功监测该病,必须为快速诊断提供足够的实验室支持,这会增加流行病学的数据,从而可以及早发现疫病,减少/预防ASFV的传播。多种准确的ASF诊断技术已被广泛运用,并且其中的绝大部分已被成功地应用于监测、控制和根除计划。然而,与其他疫病一样,没有一个检测技术是100%可靠的(敏感和特异)。因此,最终诊断应基于使用多种经过验证的检测方法所得出的结果,并结合ASF的流行病学、流行情景和临床症状的信息的解释。这就需要有流行毒株的最新知识、疫病的传播机制以及在农场和野外的表现方式。

1.1在中欧、东欧和亚洲受影响地区,ASFV流行毒株临床表现的比较

在欧洲(撒丁岛除外)和亚洲流行的ASFV毒株属于p72基因型Ⅱ型。对小基因组区域的进一步分析,可以在紧密相关的ASFV基因型Ⅱ型分离株中识别出不同的遗传变异。这些基因分型方法被用来鉴定病毒的起源,并能从遗传角度区分紧密相关的毒株。然而,目前所建立的ASFV基因型与毒力之间的相关性并不十分明确。

迄今已报道17种基因Ⅱ毒株的全基因组序列,包括ASFV-中国毒株。对所有的基因Ⅱ分离株进行序列比对显示所有这些毒株的基因组几乎都相同,它们的同一性超过99.9%。这些结果表明,在长达十年的流行传播后,欧洲ASFV基因Ⅱ型毒株显示出低突变率和高遗传稳定性,这些特性阻碍了我们对与毒力相关的可靠遗传标记的定义。在这种情况下,Zani等人发现,位于ASFV基因组5"末端的MGF110和360的26个基因的缺失可能与爱沙尼亚东北部2014株中发现的减毒表型有关。尽管该发现十分有趣,但Nurmoja等人得出结论,使用相同毒株进行野猪口鼻接种,这些毒株会导致野猪患上急性和严重的疾病,在所有的接种野猪中只有一只存活。因此,需要进一步研究与ASFV分离株毒力相关的基因标记,目前在该方面的研究仍是一个空白。

目前,确定毒株的毒力变化和致病机制的方法都是基于经典的实验感染方法。从已发表的数据来看,目前在东欧和中欧以及现在在亚洲流行的“Georgia 2007型”Ⅱ型基因分离株的大多数毒株具有高度毒性,并导致非常高的死亡率(91-100%)。在3至14天的病毒潜伏期(取决于给药途径和剂量)后,家猪和野猪均受到病毒的感染,表现出现急性临床症状,并在临床症状出现后4至7天内死亡。然而,有2%至10%的受感染动物会从ASFV的急性感染中恢复。这些在感染后存活下来的动物可能会在某些组织中建立起持续感染,并且在某些天然或诱导条件下(运输、喂食不足、免疫抑制等)可能会导致病毒的再活化,从而促进病毒的传播。此外,这些存活下来的动物受到继发性ASFV感染的保护,仍然处于亚临床感染状态,它们对环境和健康动物来说都是潜在的感染源,因为它们可能表现出低水平的病毒血症(野猪和家猪)。这就允许了ASFVs的自然进化,包括随着时间的推移出现毒性较低的形式,就像在ASF已经存在很长时间的不同地理区域发生的那样(非洲,伊比利亚半岛和撒丁岛)

尽管关于基因Ⅱ型ASFV进化为毒性较小的形式存在争议,但从野外和实验感染中获得的数据清楚地支持了这一发现。Sargsyan等人描述了2011年在Taush省Dilijan市与急性典型形式共存的ASF非典型临床形式的存在。同样,在爱沙尼亚进行的现场流行病学调查显示,在死亡率方面存在两种不同的流行病学模式,这表明该国家存在着不同毒力毒株的共流行。Gallardo等人的研究证实2015年爱沙尼亚野生野猪种群中存在中等毒力的毒株。最后,2017年在拉脱维亚从一头被猎杀的野猪身上分离出了第一个非红细胞吸附的(non- bing, non-HAD) ASFV基因Ⅱ型。家猪实验性地感染了这种非红细胞吸附的ASFV后,发展成一种非特异性或亚临床形式的疾病。

目前,有重要的知识提供了基因Ⅱ型ASFV在中、东欧自然进化的证据。在某个区域中,从急性到亚临床感染的不同ASF临床形式的共存,或多或少地取决于受影响的区域对疫病的识别和早期检测。了解疫病的临床表现和感染动态,包括发病机制和免疫反应,是正确使用现有诊断工具和设计有效控制和根除计划的关键步骤。

02

可用的ASF诊断技术

本节将对用于ASF诊断的技术进行讨论和回顾研究,主要是讨论它们的优缺点以及在未来可优化的诊断策略前景。

2.1. 病毒检测技术

由于ASF的急性特征进行被动监测是最有效的方法,同时被动监测也是在无疫病区进行早期检测的最有效的方法。必须从病畜或死亡动物身上取得的样本后(血液和靶器官)进行检测,以否定或确认ASFV的感染情况。因此,病毒学检测方法对于快速实施疫病的控制措施至关重要六开彩预测内部。这些病毒学检测方法包括通过PCR检测病毒的基因组、通过抗原ELISA或直接免疫荧光试验(DIF)检测病毒的抗原以及使用病毒分离技术进行病毒检测。表格1总结了当前经过验证的ASFV检测诊断方法。

2.1.1.ASFV基因组检测

目前,PCR被认为是早期检测ASFV的金标准试验,因为PCR具有较高的敏感性、特异性、稳健性和高通量性,可检测家猪、野猪和软蜱的任何一种临床样本中的ASFV基因组。

在过去的20年中,已经开发和验证了多种PCR检测方法,其中包括传统PCR方法和实时PCR方法(rPCR),主要用于检测不同的已知病毒基因型、非红细胞吸附株和不同毒力的各种ASF分离株。所有这些PCR检测方法都是在VP72编码区设计的,这是一段编码主要病毒蛋白的高度保守基因,可确保检测到任何ASFV分离株。OIE rPCR和通用探针库(UPL)rPCR是欧盟国家参考实验室(NRL)级别最常用的常规的诊断方法。这两种方法都能够提供可靠的ASF诊断,当然UPL-PCR对于幸存动物的检测具有更高的灵敏度,并且即使在典型的临床症状尚不明显时UPL-PCR也可以更早地检测到疾病

由于新的病毒分离株可以随时出现新的遗传模式,因此定期进行常规PCR的检测是非常重要的。在这方面,欧盟ASF(EURL)参考实验室已经宣布,世界卫生组织推荐的常规PCR在检测当前流行的ASFV基因Ⅱ型毒株时显示出低于预期的敏感性。这是由于在流行毒株中存在反向引物的3"末端附近核苷酸的错配。同样,用于ASFV/CSFV检测的多重聚合酶链式反应的CSFV引物也不适用于检测最近从加勒比地区分离出来的属于1.3基因型的CSFV毒株。

为了在单次测试中可以同时进行检测和差异检测,已经研发出了多重聚合酶链式反应运用于在ASFV和其他猪病原体,例如经典猪瘟病毒(CSFV)。这些技术对于在CSF和(或)ASF进入高危无疫病区以及在两种病毒同时传播的情况下进行监测是有用的,尽管这种检测方法与单次检测相比,诊断敏感性会较低。

关于其他的分子检测方法,等温化验可能是比PCR检测更便宜的另一种诊断替代品,并且可以在野外条件下使用。在有临床症状的病例中,等温化验的敏感性似乎足以检测急性病例。然而,由于其基因组检测水平明显低于PCR,因此不建议将这些检测用于已恢复的动物或携带病毒动物的检测。这些受感染的动物能够传播(散落)病毒,但本身没有临床疾病的迹象。尽管这些技术已经被研发出来,但仍然缺乏现场数据的验证。

此外,近年来,基于已发表的rPCRs检测方法,用于ASFV基因组检测的商业试剂盒的数量已经大大增加 。这就说明具有一种替代的检测方案可以保证结果的同质性,这对于建立起许多实验室都可采用的测试程序是非常重要的。每一种新的ASF商业检测方法都必须在国际指导下进行评估和验证,以确保其特异性、敏感性、重现性、精确性、稳定性和准确性。

综上所述,PCR是监测急性或亚急性临床病程感染动物的长期病毒血症和高病毒载量的基本诊断工具。此外,只有最敏感的PCR检测方法才能在感染的最初几天检测到低的病毒载量,并在慢性或亚临床感染过程的动物中诊断出的弱散发性的病毒血症。在亚临床感染过程的情况下,除了PCR检测,血清学试验在识别受感染动物中也发挥着关键作用。

2.1.1. 病毒分离(Ⅵ)和红细胞吸附(HAD)测试

从野外获得的正在流行的ASFV分离株是诊断的关键步骤。理论上讲,所有从自然暴发中收集的ASFVs都可以从猪源性易感原代白细胞培养物中分离出来,这些原代白细胞培养物要么来自血液,要么来自肺(肺泡)单核细胞,要么来自巨噬细胞。如果ASFV存在于猪样品中,它将在细胞中复制并产生细胞病变效应(CPE)和红细胞吸附反应(HAD),这是ASFV感染细胞的一个特征,广泛地用于诊断。由于没有其他的猪病毒能够在白细胞培养物中进行血液吸附,因此HAD检测方法成为ASFV在初次爆发时的确证检测方法。然而,从野外采集的样本中不一定能分离出感染性病毒。Gallardo等人报道了在检测从欧洲受影响地区采集的野猪场提取的样本时,尽管样本中存在很高的病毒DNA值,但分离出病毒的比率却比较低(30.7%)。EURL的进一步研究证实了这些发现。从1719份PCR检测阳性的病毒分离样品中,仅有404份(23%)分离出了病毒。没有分离出病毒的样品主要来自野猪,从1302个检测样品中仅有233个分离出ASF病毒(18%)。原因主要在于接收到的样本状况不佳,这直接影响了病毒的生存能力,特别是这些样本中的绝大部分是从死亡或被猎杀的动物身上获得的。此外,一些野外毒株不表现出HAD,而只表现出CPE ;这些非HAD病毒不易分离,需要使用PCR或DIF进一步对细胞培养物的沉积物进行检测确认。

在初次爆发或发生ASF病例时,建议使用Ⅵ和HAD检测作为参考验证性试验 ,但它不可能是NRLs进行ASF诊断的最有成效的方法。它比其他技术更昂贵,需要专门的设施和培训,耗时且无法进行高通量检测。然而,尽管存在这些限制,进行病毒分离以获得病毒库然后再进行更深入的分子和生物学特性研究也是至关重要。这些问题最初是通过使用非洲绿猴肾建立的细胞系,如VERO或猴稳定(MS)细胞系来克服的,其中一些ASFV分离株已适应培养,但仅适用于那些可以使用细胞适应培养毒株的分离。Hurtado等人,在2010年时将COS-1细胞描述为对所有的ASFV分离株敏感的既定细胞系,允许扩增任何病毒样品用于诊断,检测和生产。此外,感染细胞系如IPAM或源自猪肺泡巨噬细胞的野猪肺细胞(WSL)可能更接近自然的环境的(猪、巨噬细胞)有助于更精确地模拟体内ASFV感染的过程。当然,使用这些细胞并非没有缺点,最近发表的研究表明,猪细胞系JPAM、WSL均未表现出成熟的巨噬细胞的表型,其中只有WSL能够维持ASFV扩增感染,尽管WSL细胞也是毒株依赖性的。

最后,尽管这些细胞系与原代细胞相比具有许多众所周知的优势,但它们并不总是适合于从野外样品分离出的没有明显的适应性的ASFV毒株。因此,在ASF诊断中,所建立细胞株的潜在应用还需要进一步的评估研究。

2.1.2. 抗原检测技术

抗原检测技术在过去被广泛应用于假定诊断。其中,直接免疫荧光法(DIF)是一种“内部”技术,用于检测脏器涂片或薄层冰冻切片中的病毒抗原,并且可用于从非HAD菌株的Ⅵ中鉴定出ASFV。DIF是一种快速检测方法,对严重和急性的HAD和非HAD的ASFV毒株有足够的特异性和灵敏度。然而,在感染后第一周出现抗体反应时,由于抗原抗体复合物的存在使得该技术的敏感性显着下降,会导致较高的假阴性结果。此外,该技术无法进行高通量检测并且结果的判读可能是具有主观性的,因此需要熟练的操作人员。另一方面,所需的ASFV特异性抗体荧光素偶联物很难达到预期的质量标准条件。

在过去研发出了很多“内部”抗原EKISA的方法,虽然很多在现在不再使用,这些ELISA方法包括使用单克隆和多克隆抗体的直接ELISA、间接ELISA和夹心ELISA。目前商业上生产的抗原ELISA试剂盒是唯一可用的试剂盒(ELISA INgezim PPA DAS,Ingenasa,Spain),可以使用动物的组织和血清样品进行检测分析。这是一种快速的检测方法,可以进行大规模检测。然而,对277个来自实验感染猪和野猪和家猪的野生样本进行的比较检测结果表明,即使是在存在高病毒载量的野生样本的情况下,与UPL-PCR相比,商业抗原ELISA检测的敏感性较低(77。2%)。

因此,直接免疫荧光法(DIF)或抗原ELISA的使用仅推荐作为畜群的测定,并且应与其他一些病毒学和血清学测试相结合。

2.2. 抗体检测试验

血清学检测是最常用的诊断方法,因为它们简单,成本相对较低,并且只需要轻便的专用设备或很少的设施。对于ASF诊断来说,抗体检测结果的可信度特别高,因为目前还没有针对ASFV的疫苗,这就意味着抗ASFV抗体的存在总是表明动物的感染。此外,抗ASFV抗体在感染后很快就会出现并持续存在长达数月甚至数年 。因此,抗体的监测对于存活动物的检测至关重要,可以根据抗体的检测结果来阐明流行病的流行病学特征,即病毒进入农场后的时间以及检测低毒力ASFV分离株的入侵。抗体检测技术的使用对于过去根除计划的成功实施也是至关重要的。

前由OIE批准的基于ASFV抗体的试验包括使用ELISA进行抗体筛选,用蛋白质印迹法(IB)、间接免疫荧光法(IIF)或间接免疫过氧化物酶试验(IPT)作为证实试验。(见表 2)

表2.经过验证的ASFV抗体检测方法

2.2.1. 抗体-ELISA(酶联免疫吸附试验)

用ELISA法检测ASFV的特异性抗体是目前国际贸易中OIE规定的检测方法。目前有许多关于ASF的ELISA检测方法,包括重组ELISA 和几个基于使用活病毒作为抗原的OIE“内部”检测方法。三种商用ELISA试剂盒也可用于检测ASF抗体,这些抗体使用的都是目前最常被描述的抗原蛋白,如p72、p32、pp62和p54 (INGENASA、IDVET和SVANOVIR),其中INGEZIM PPA COMPAC、K3来自INGENASA,在欧盟国家中最广泛的使用。

六开彩预测内部有报道称,与证实性血清学检测相比,ELISA对7-12dpi的抗体检测灵敏度较低。尽管如此,对于检测12 ~ 14 dpi的特异性抗体来说,ELISA是一种非常可信的检测方法,因此ELISA检测仍然是大规模血清学研究中最有用的方法;这种方法检测速度,易于执行且经济实惠。但是,只能分析血清样品,这就限制了其应用范围。由于缺乏特异性,当检测组织时,“内部”或商业ELISA检测方法的准确性约为80%。这是目前欧洲疫情检测的一个不足之处,在欧洲,野猪ASF的诊断是非常重要的。通常从猎杀/捕获的动物或被发现死亡的动物中获得的样品,然后被送到实验室以确定疾病的存在。因此,样本的类型可能会限制对该病的全面诊断,特别是在可能传播中、低毒力毒株的地区。目前这一问题已经被一些NRLs通过运用间接免疫过氧化物酶试验(IPT)测试解决,IPT测试可以很容易地分析所有类型的组织样本渗出物,其中包括骨髓。然而,应该优先发展标准化的ELISAs,可以用于检测组织提取物中特定的ASF病毒抗体,以便更容易和更可靠地评估受影响地区的疫病的流行病学情况。

2.2.2. 抗体确认检测试验

正如世界动物卫生组织(OIE)建议的那样,阳性ELISA结果应始终通过其他方法进行确认,如IPT,IIF或IB测试。免疫印迹试验(IB) 是一种快速、灵敏的特异性抗体检测方法,通过抗体对抗原蛋白的特异性反应,可以很好地识别弱阳性血清样品(IP 12, IP 23, IP 25, IP 25.5, IP 30, IP 31, IP 34 and IP 35)。这些多肽开始通过IB与动物感染后7-9天的血清发生阳性反应,大多数多肽在感染后数月的血清中仍保持阳性反应。尽管该方法是高度敏感的,但与上述其他方法类似,只有血清样品可用于IB测试。此外,在存在亚临床的慢性感染动物的ASF疫区,还会看到非特异性的反应,这会阻碍对结果的解释。在这种情况下,应考虑使用IIF 或IPT 等替代验证性血清学诊断测试,以便对结果进行准确的评估。这两种检测方法都是基于相同的原理,需要使用经适应的ASFV毒株感染的经固定培养的VERO或MS单层细胞系。这些方法具有很高的特异性和敏感性,但结果的解释可能是主观的,并且需要有专业的工作人员。尽管有这种限制,IPT已被证明是ASF血清学诊断的最佳方法,因为它具有很高的灵敏度,而且可以检测任何来自猪的不同的样品,如血液,渗出组织或体液等。这对野猪的监测和控制计划尤其重要。目前,IPT检测是欧盟NRLs的选定的确认检测方法。

验证性血清学方法的主要缺点是,这些技术都不是由公司商业化生产的,这限制了它们在实验室的使用,特别是那些资源有限的实验室。EURL在2016年进行了一项调查,旨在回顾欧盟层面ASF诊断的优势和临界点,结果显示,25%的NRLs将实施验证性抗体验证试验作为主要临界点。商业验证血清学检测的可用性应该是未来工作的重点。

03

关于ASF诊断的一些考虑因素

虽然对于ASF来说目前已有可用的经过充分验证的诊断方法,但是,根据其在全世界的流行病学情况,都强调了改进现有检测工具的必要性,以便缩短在无疫病区发现ASFV新病例和进行疫病控制之间的时间间隔本节对ASF诊断研究的最新进展进行综述,重点是考虑到欧洲流行病学情况,使用新的矩阵方法选择替代样本。为了诊断的有效性,选择合适的样本结合适当的诊断方法,对于快速、可靠地疫病诊断至关重要。

3.1. 临床检测技术

在过去从临床怀疑到实验室确认之间的时间相对较长,这是由于向官方实验室发送样本的复杂后勤工作。另一方面,是因为在大多数情况下,区域实验室没有诊断诸如ASF等外来疫病的专业知识、设备和(或)设施。此时,我们可以通过使用临床检测在现场条件下进行第一前线诊断来进行分类,以提供关于动物感染状况的实时数据。INGENASA目前已经有两种不同的检测血液中抗体或病毒抗原的横向流动装置(LFDs),预计在不久的将来还会有其他几种。Sastre et al.描述的用于抗原检测的pen-side test (INgezim ASF CROM Ag)是基于对ASFV的VP72蛋白的单克隆抗体的使用,当对来自实验感染的样本进行检测时,其敏感性与商业抗原-ELISA试剂盒相似。LFD被证明对于循环病毒量超过104 红细胞吸附单位(HAU)的动物是阳性的。在检测现场样品时,LFD所检测出来的值会超过了抗原-ELISA法的检测值,其阳性率检出率为60%,而抗原ELISA法的阳性率检出率为48%,与金标准的rPCR检测法相比,LFD的敏感性会相对较低。关于抗体检测的笔侧分析(INgezim PPA CROM),最近在撒丁岛野外条件下对猎杀野猪的研究与商业抗体INGENASA ELISA和IPT(在实验室条件下具有更好的性能)相比,显示出82%的灵敏度和96%的特异性。除了用于ASF的单一LFD外,CSF也有多向LFD的报道,这将有助于现场对这两种疾病进行监测。

临床检测技术的使用提供了第一线诊断的结果,可在卫生紧急情况下进行快速应用。然而,从已发表的数据来看,LFD不应该单独使用,因为与金标准方法相比,LFD检测抗原的敏感性非常有限。一般来说,检测的敏感性的需求会很高,而特异性则不那么重要,因为任何检测为阳性结果都会通过NRL检测进行验证。在农场或现场筛查中使用临床检测需要限于官方兽医或有一定资源的区域实验室,此外还需要考虑到一些其他具体的情况。

3.2. 用于ASF诊断的替代样本

野猪取样已被证明是欧盟内部进行被动和主动监测的瓶颈。非侵入性采样策略可能意味着通过规避适性偏倚狩猎/捕获采样的方案来优化对野生动物的监测。近年来,在实验和现场条件下,对不同的活体采样方法进行了评价。据报道,收集未经处理的现场粪便样本是对野猪和散养猪进行ASFV和抗体检测 的一种替代的非侵入性监测方法。然而,有活性的ASFV的短期存活率、对温度的依赖性以及ASFV毒株在毒力方面的差异表明对粪便样本的分析不是一种足够敏感的方法,不能用于对野猪的监测。欧洲ASF协会(INIA- CISA)最近的一项研究证实了这一发现。从实验感染了具有不同毒力的基因Ⅱ型的ASFV的家猪中取出粪便,通过PCR分析表明,只有8%的亚急性或慢性感染动物的粪便含有该病毒。相比之下,从患有急性疾病的动物的粪便中很容易检测到ASFV,尽管在粪便中检测到的病毒会比在血液中检测到病毒晚两到四天,但这与疾病的急性发展期很相符。此外,应该记住,病毒在野外的平均寿命受到粪便和尿液中细菌所产生的酶(蛋白酶和脂肪酶)的强烈影响,因此在ASF积极传播的区域中,病毒确切存活时间与实验室条件下的估算值不完全可比。

利用滤纸和拭子上的干血斑(DBS)进行抗体检测和ASFV基因组的检测具有良好的特异性和相对合适的敏感性。这些矩阵避免了样本运送到实验室的过程中所需要的冷链保存,并且这种方法会相对便宜,只需要很小的样品量,并且收集样品所需的专业技术也很少。这些因素可能会使猎人采集样本更容易,并且可能是野猪监视计划中经典采血方案的替代方案。

最后,近期的研究表明了可以利用(诱饵)绳索收集口腔液作为抗体检测和ASFV基因组检测的合适策略。总之,通过非侵入性采样方法获得的样本,例如滤纸上的口腔液或干血,可能是野猪监测计划中ASF检测的合适方法。然而,尽管显示出有希望的结果,但仍需要使用来自家猪和野猪群的各种样品来验证用此类矩阵方法的ASF的采样、存储、处理和测试的标准化方案的稳定性。

3.3. 混合样本对ASF病毒检测的影响

由于欧盟国家目前的疫病流行状况,使得将EDTA血液样本汇集到一起进行NRLs检测成为一种常见的做法,这样可以降低PCR分析成本,并提高检测量。当然,这也意味着样品被稀释,这可能会影响rPCR检测ASFV DNA的能力。

EURL开展了一项研究,以高敏感性的UPL rPCR作为参考方法,评价了运用混合样本检测单一asfv阳性动物的效果。根据循环阈值(Ct),从基因Ⅱ型ASFV感染猪中筛选出101个EDTA血液样品。样品运用ASFV阴性猪血液中进行1:3,1:5,1:10和1:20的比例稀释(在3、5、10和20组样品中模拟1个阳性样本的存在),运用UPL rPCR分别检测到99%,89%,82%和72%的阳性率。在病毒载量较低(Ct > 35)的病毒血症期开始或结束时采集的样本中,混合样本对rPCR敏感性的影响更大。这些结果表明,如果在病毒血症刚开始时从动物身上提取的血液样本进行1:5的混合(或更高的比例),则可能无法在混合的样本中检测到病毒DNA,而可以在单个样本中检测到病毒DNA。用rPCR对动物进行单独检测是检测动物中活性ASFV感染的最敏感方法。而EDTA血液样本的混合可用于检测来自ASF流行地区的动物的ASFV。在这种情况下,最适当和最有效的策略将是将来自单一地理位置或群体的动物按1:3的比例进行混合检测,因为在一个单位中不太可能存在单一感染ASF的动物。

04

结语:ASF诊断解释

对ASF的诊断就是对已经或曾经感染ASFV的动物进行鉴定。因此,适当的诊断包括检测和鉴定ASFV异性抗原或DNA和抗体,以获得疫病控制和根除方案的相关信息

为了获得正确的诊断,重要的是要考虑实验室检测结果和流行病学检查结果。对猪中高毒力ASFV的发病机理的研究表明,原发性病毒血症可在感染后8小时检测出,继发性病毒血症可在感染后15至24小时检测出。脾脏,淋巴结,肝脏和肺脏显示为继发性病毒生长的部位,30小时后,所有组织都含有病毒,接种后72小时达到最大病毒滴度。即使没有临床表现,动物也可在感染后的四天内死亡。通过rPCR,Ⅵ甚至使用抗原检测技术(DIF或ELISA),可以在任何种类的猪样品中轻松地检测到ASFV。目前还没有研发出相应的抗体。

在由毒性毒株引起的急性感染中,根据感染的剂量和途径,临床症状可从4天到19天不等,感染后5-12天死亡。一旦动物被感染,通常平均会在3.75±1.4天在血液中检测到ASFV基因组,即临床症状发作的前两天。猪感染急性致死性疫病后,通常在第一例病例出现后的第一周内会死亡。ASFV存在于所有猪的样品中,主要在骨髓,脾脏,肝脏,淋巴结,肺和扁桃体中显示高病毒载量。IPT最早可在7~8天内检测到微弱的抗体反应(图1a), 即在ELISA检测前2~3天即可检测到微弱的抗体反应,尽管后者很少检测到。

中度毒性毒株参与急性(猪死11-15dpi)和亚急性(动物死亡20dpi)形式的出现。临床上,急性ASF的发生时间为7天,而亚急性ASF的发生时间为10-20天。亚急性ASF的死亡率从30%到70%不等%。在急性感染中,病毒血症可在3 dpi时用rPCR检测,而在亚急性感染的家猪中,病毒血症的平均检测时间为8.5±3.6天。IPT检测抗体的通常时间为8 ~ 10天,从第三周开始平均抗体滴度达到1:20 000(图1b)。经rPCR和Ⅵ检测,所有在第一个月内死于中度毒力毒株感染的动物组织均为阳性。

在急性或亚急性感染后存活下来的猪,病毒DNA可以在其血液中持续存在78天,虽然Ⅵ的阳性结果主要在第一个月内获得血液中检测到,但偶尔也会在第66天内在获得的血液中分离到。第二个排泄高峰的出现可能与持续感染组织中病毒复制的新周期有关,这表明感染后78天,从实验感染爱沙尼亚中等毒力基因型Ⅱ型毒株猪的扁桃体中恢复感染病毒是可能的。

慢性ASF与中等毒力到低毒力分离株的感染有关。患有慢性感染的动物表现出非特异性的临床症状,在某些情况下甚至时无症状。患慢性ASF型病变的猪从感染后的第一周开始出现反复发热和虚弱和/或间歇性病毒血症(周期阈值CT>30),这种症状可持续两个月以上。相反,保持无症状的猪通常是非病毒性的。尽管没有病毒血症和临床症状,但使用IPT和ELISA在第一周后很容易在所有动物中检测到特异性抗体,一个月后抗体水平会达到 1:160,000,并且在一段时间内保持不变 (Fig. 1c) 。组织中的病毒复制显示,在肺和胸淋巴结中病毒会存在长达99天,在咽后淋巴结和颌下腺淋巴结中是101天 。

图1。随着时间的推移的病毒血症(通过实时PCR测定)和抗体反应(由IPT测定)以及与ASF病毒的感染阶段的相关性,正如欧洲家猪感染了在欧盟流行的Ⅱ型asfv分离株观察到的情况一样(2014-2018年)。以条形表示临床评分,与病毒血症和抗体反应重叠。

这些数据强调了这样一个事实,即仅基于临床症状和ASFV基因组检测的早期检测并不是在欧洲目前流行病学情况下对ASF的控制的一种有效方法。欧洲野猪很可能在欧盟的某些地区受到地方性感染,成为其他野猪以及家猪的反复感染源。

由于每种动物可能处于疾病的不同阶段,无论是病毒检测还是抗体检测,为了确认短暂的病毒血症和抗ASFV特异性抗体的存在,都可以使亚临床感染ASFV的野猪或家猪被检测出来。病毒的阳性测试结果表明受试动物在取样时正受到病毒的感染。

另一方面,阳性ASFV抗体测试表明动物患有持续感染或正从过去的感染中恢复(并可能终生血清反应阳性)。这些抗体的效价可以反映受感染动物的生存时间。因此,抗体检测技术对于获得病毒控制和根除方案的完整信息至关重要。

应审查和更新具有明显流行趋势地区的控制根除规划,并包括平行常规实验室监测,并定期进行临床检查。使用最合适的诊断工具,结合ASF病毒和抗体检测,都将提高疾病控制措施的效力,无论流行的ASFV毒株的性质如何 。

本文仅代表作者观点

池秋燕翻译

陈佳宁博士审阅

周盼伊修改整理

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